Development and validation of homebrew FISH Probes for 22q11.2 deletion syndrome

Desenvolvimento e validação de sondas in house para FISH para a síndrome de deleção 22q11.2

Luiza Emy Dorfman1,2; Patrícia Trevisan1,3; Diego A. Paskulin4; Maiara A. Floriani1; Luiza Carolina R. Scherner1; Naiane C. Bassani1; Andressa S. Santos1; Rafael F. M. Rosa1,5; Paulo Ricardo G. Zen1,5
J Bras Patol Med Lab. 2021; 57: 1-7.
DOI: 10.5935/1676-2444.20210058

ABSTRACT

Introduction: The molecular cytogenetic technology of fluorescence in situ hybridization (FISH) allows the identification of submicroscopic chromosomal alterations in congenital diseases. The 22q11.2 deletion syndrome is one of the most frequent genetic diseases in humans, and has a very broad and variable clinical phenotype, which difficults the clinical diagnosis. Although it has the possibility of submicroscopic changes identification using array-comparative genomic hybridization (CGH), multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and bacterial artificial chromosomes (BACs)-on-beads; FISH probes are still used to diagnose or confirm the results of these techniques. Objective: The present study aimed to establish the technique of manufacturing DNA probes for FISH for the diagnosis of 22q11.2 deletion with reduced costs for the public health systems. Material and methods: In house development of FISH probe assays consists of several sequential processes. Initially the BACs were identified and selected, then they were grown, and, afterwards, their DNA was extracted and amplified. The amplified DNAs were labeled with fluorochromes by Nick-translation technique. After probes development, the validation was performed on normal control samples and on altered samples. Results and conclusion: On normal samples, we achieved 93.55% of sensitivity, 99.2% of specificity and 99.8% of efficiency. These manufactured probes cost 8.5 times lower than the commercial ones.

Key words: DiGeorge syndrome; in situ hybridization fluorescence; molecular probes.

RESUMO

Introdução: A tecnologia de citogenética molecular de hibridização in situ fluorescente (FISH) permite a identificação de alterações cromossômicas submicroscópicas em doenças congênitas. A síndrome de deleção 22q11.2 é uma das doenças genéticas mais frequentes no ser humano e tem um fenótipo clínico muito amplo e variável, o que dificulta o diagnóstico clínico. Embora tenha a possibilidade de identificação de alterações submicroscópicas usando array-CGH, multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) e cromossomos artificiais bacterianos (BACs)-on-beads, as sondas para FISH ainda são utilizadas para diagnosticar ou confirmar os resultados dessas técnicas. Objetivo: O objetivo deste estudo foi estabelecer a técnica de produção de sondas de ácido desoxirribonucleico (DNA) para FISH para o diagnóstico de deleção 22q11.2, com custos reduzidos para os sistemas de saúde pública. Material e métodos: O desenvolvimento interno de ensaios de sondas para FISH consiste em vários processos sequenciais. Inicialmente, os BACs foram identificados e selecionados; depois foram cultivados e, posteriormente, o seu DNA foi extraído e amplificado. Os DNAs amplificados foram marcados com fluorocromos pela técnica de Nick-translation. Após o desenvolvimento das sondas, foi efetuada a validação em amostras de controle normais e em amostras alteradas. Resultados e conclusão: Em amostras normais, conseguimos 93,55% de sensibilidade, 99,2% de especificidade e 99,8% de eficiência. Essas sondas fabricadas custaram 8,5 vezes menos do que as sondas comerciais.

Unitermos: síndrome de DiGeorge; hibridização in situ fluorescente; sondas moleculares.

RESUMEN

Introducción: La tecnología de citogenética molecular de hibridación in situ fluorescente (FISH) permite la identificación de alteraciones cromosómicas submicroscópicas en enfermedades congénitas. El síndrome de deleción 22q11.2 es una de las enfermedades genéticas más frecuentes en el ser humano y tiene un fenotipo clínico muy amplio y variable, lo que dificulta el diagnóstico clínico. Aunque es posible identificar alteraciones submicroscópicas utilizando array-CGH (hibridación genómica comparada por microarreglos), amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPA) y cromosomas artificiales bacterianos (BACs)-on-beads, las sondas FISH todavía se utilizan para diagnosticar o confirmar los resultados de estas técnicas. Objetivo: El objetivo de este estudio fue establecer la técnica de producción de sondas de ácido desoxirribonucleico (ADN) FISH para el diagnóstico de deleción 22q11.2, con costos reducidos para los sistemas de salud pública. Material y métodos: El desarrollo interno de ensayos de sonda para FISH consta de varios procesos secuenciales. Inicialmente, se identificaron y seleccionaron BACs; luego se cultivaron y, posteriormente, se extrajo y amplificó su ADN. Los ADN amplificados se marcaron con fluorocromos utilizando la técnica de Nick-translation. Después del desarrollo de las sondas, se realizó una validación en muestras de control normales y en muestras alteradas. Resultados y Conclusión: En muestras normales, logramos una sensibilidad del 93,55%, una especificidad del 99,2% y una eficiencia del 99,8%. Estas sondas fabricadas cuestan 8,5 veces menos que las sondas comerciales.

Palabras clave: síndrome de DiGeorge; hibridación in situ fluorescente; sondas moleculares.