False-negative result in molecular diagnosis of SARS-CoV-2 in samples with amplification inhibitors

Marcelo Fruehwirth; Açucena V. Rivas; Andressa F. R. Fitz; Aline Cristiane C. A. Batista; Cleypson Vinicius Silveira; Robson M. Delai
J. Bras. Patol. Med. Lab. 2020;56(1):1-8
DOI: 10.5935/1676-2444.20200060

ABSTRACT

INTRODUCTION: Although reverse transcription-polymerase chain reaction (rRT-PCR) is the gold standard method for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), some factors, such as the presence of amplification inhibitors, lead to false-negative results.
OBJECTIVE: Here we describe the differences between rRT-PCR results for SARS-CoV-2 infection in normal and diluted samples, simulating the need for dilution due to the presence of amplification inhibitors.
MATERIAL AND METHOD: Viral ribonucleic acid (RNA) from samples of nasopharyngeal swabs from 20 patients previously detected as “Negative” and 21 patients detected as “Positive” for SARS-CoV-2 was performed with the EasyExtract DNA-RNA kit (Interprise®). The rRT-PCR was performed with the OneStep/COVID-19 kit (IBMP), with normal and diluted (80 µl of H2O RNAse free) samples, totaling 82 tests.
RESULTS: The results indicate that there is an average variation (α < 0.05) delaying the Cq between the results of amplification of the internal control (IC), N gene (NG), and ORF1ab (OF), 1.811 Cq, 3.840 Cq, and 3.842 Cq, respectively.
DISCUSSION: The extraction kit does not completely purify the inhibitor compounds; therefore, no amplified product result may occur. In this study, we obtained a 19.04% false-negative diagnosis after sample dilution; this process reduces the efficiency of rRT-PCR to 29.8% in detecting SARS-CoV-2.
CONCLUSION: Knowing the rRT-PCR standards of diluted samples can assist in the identification of false-negative cases and, consequently, avoid incorrect diagnosis.

Keywords: COVID-19; rRT-PCR; dilución; diagnóstico virológico; extracción de ARN.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: Aunque la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa en tiempo real (rRT-PCR) sea el método de referencia para detección del coronavirus tipo 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2), algunos factores como la presencia de inhibidores de amplificación conducen a resultados falsos negativos.
OBJETIVO: Describimos las diferencias entre los resultados de rRT-PCR para infección por SARS-CoV-2 en muestras normales y diluidas, simulando la necesidad de dilución debido a la presencia de inhibidores de amplificación.
MATERIAL Y MÉTODO: La extracción de ácido ribonucleico (ARN) viral de muestras de hisopos nasofaríngeos de 20 pacientes previamente detectados como “negativos” y 21 pacientes detectados como “positivos” para SARS-CoV-2 se realizó con el kit Easy Extract DNA-RNA (Interprise®). La rRT-PCR se realizó con el kit OneStep/COVID-19 (IBMP), con muestras normales y diluidas (80 µl de H2O libre de ARNasa), totalizando 82 pruebas.
RESULTADOS: Los resultados indican que hay una variación media (α < 0,05) retrasando el ciclo de cuantificación (Cq) entre los resultados de amplificación del control interno (CI), gen N (GN) y ORF1ab (OF) de 1,811 Cq, 3,840 Cq y 3,842 Cq.
DISCUSIÓN: El kit de extracción no purifica completamente los compuestos inhibidores; por lo tanto, puede ocurrir no amplificación. Obtuvimos un diagnóstico falso negativo de 19,04% después de la dilución de la muestra; ese proceso reduce la eficiencia de la rRT-PCR hacia 29,8% en la detección de SARS-CoV-2.
CONCLUSIÓN: Conocer los patrones de la rRT-PCR de muestras diluidas puede ayudar en la identificación de casos falsos negativos y, por consiguiente, evitar un diagnóstico equivocado.

Palabras-clave: COVID-19; rRT-PCR; dilución; diagnóstico virológico; extracción de ARN.

RESUMO

INTRODUÇÃO: Embora a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (rRT-PCR) seja o método padrão-ouro para detecção de coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), alguns fatores como a presença de inibidores de amplificação levam a resultados falso negativos.
OBJETIVO: Descrevemos as diferenças entre os resultados de rRT-PCR para infecção por SARS-CoV-2 em amostras normais e diluídas, simulando a necessidade de diluição devido à presença de inibidores de amplificação.
MATERIAL E MÉTODO: A extração de ácido ribonucleico (RNA) viral de amostras de suabes nasofaríngeos de 20 pacientes previamente detectados como “negativos” e 21 pacientes detectados como “positivos” para SARS-CoV-2 foi realizada com kit o EasyExtract DNA-RNA (Interprise®). A rRT-PCR foi realizada com o kit OneStep/COVID-19 (IBMP), com amostras normais e diluídas (80 µl de H2O RNAse-free), totalizando 82 testes.
RESULTADOS: Os resultados indicam que existe uma variação média (α < 0,05) atrasando o Cq entre os resultados de amplificação do controle interno (CI), gene N (GN) e ORF1ab (OF) de 1,811 Cq, 3,840 Cq e 3,842 Cq, respectivamente.
DISCUSSÃO: O kit de extração não purifica completamente os compostos inibidores, portanto, pode ocorrer não amplificação. Obtivemos um diagnóstico falso negativo de 19,04% após a diluição da amostra; esse processo reduz a eficiência da rRT-PCR para 29,8% na detecção de SARS-CoV-2.
CONCLUSÃO: Conhecer os padrões da rRT-PCR de amostras diluídas pode auxiliar na e, consequentemente, evitar um diagnóstico incorreto.

Palavras-chave:

Unitermos: COVID-19; rRT-PCR; diluição; diagnóstico viral; extração de RNA.