Anticancer drug screening: standardization of in vitro wound healing assay

Vitor M. Almeida; Maximino Alencar Bezerra Jr.; Jéssica C. Nascimento; Lidia Maria F. Amorim
J. Bras. Patol. Med. Lab. 2019;55(6):606-619
DOI: 10.5935/1676-2444.20190054

ABSTRACT

INTRODUCTION: Gliomas are characterized by rapid proliferation and aggressive invasion into normal surrounding brain tissue. In medical laboratories, the in vitro wound healing assay stands out as a simple, easy, inexpensive and affordable method to evaluate cell migration and proliferation.
OBJECTIVE: To standardize the in vitro wound healing assay using antimicrotubule drugs as positive controls.
METHODS: U87MG glioma cells were seeded at different densities and, after 24 h, the monolayer was scratched using different micropipette tip size to create a gap with no cells. The cells were then treated with colchicine and paclitaxel in culture medium with the presence or absence of fetal bovine serum. The wound was photographed with the aid of an inverted microscope and the wound area was measured using the Image J software.
RESULTS: Better defined edges scratches and monolayer with approximately 90% confluence were obtained at 1.5 and 2 x 105 cells/well density. The width and area of the scratch were, respectively, 948 µm/2.193221 mm2; 964 µm/2.266 mm2 and 1448 µm/3.221 mm2 to 10. 200 and 1000 µl micropipette tips. Colchicine inhibited wound closure by 12.6% or 3.4%, both in the presence or absence of serum; paclitaxel 2.4 and 6.7% respectively.
CONCLUSION: Under standardized conditions, colchicine and paclitaxel proved to be efficient positive controls into the in vitro wound healing assay.

Keywords: colchicine; paclitaxel; glioma; cell proliferation; cell movement; antitumor drug screening assays

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: Gliomas se caracterizan por rápida proliferación e invasión agresiva del tejido cerebral normal circundante. En laboratorios médicos, el ensayo de cierre de herida – una prueba in vitro – se destaca por ser un método simple, fácil, de bajo costo y accesible para evaluar la migración y la proliferación celular.
OBJETIVO: Estandarizar el ensayo de cierre de herida usando agentes anti-microtúbulos como control positivo.
MÉTODOS: Las células de glioma U87MG fueron sembradas en diferentes concentraciones y, después de 24 horas, la monocamada fue rayada con punteras de diferentes tamaños para crear una hendidura sin células. Las células fueron entonces tratadas con colchicina y paclitaxel, en medio con o sin suero fetal bovino. La ranura fue fotografiada con la ayuda de un microscopio invertido, y el área de la ranura fue medida mediante el programa Image J.
RESULTADOS: Ranuras con bordes más bien-definidos y monocamada con alrededor de 90% de confluencia se obtuvieron con 1,5 y 2 × 105 células/pozo. La anchura y el área de las ranuras obtenidas fueron, respectivamente, 948 µm/2,193 mm2; 964 µm/2,266 mm2; y 1448 µm/3,221 mm2 para las punteras de 10, 200 y 1000 µl. La colchicina inhibió el cierre de las ranuras en 12,6% o 2,4%, tanto en presencia como en ausencia de suero; el paclitaxel, 3,4% y 6,7%, respectivamente.
CONCLUSIÓN: En condiciones estandarizadas, colchicina y paclitaxel pueden ser usados como control positivo en el ensayo de cierre de herida in vitro.

Palabras-clave: colchicina; paclitaxel; glioma; proliferación celular; movimiento celular; ensayos de selección de medicamentos antitumorales.

RESUMO

INTRODUÇÃO: Gliomas são caracterizados por terem rápida proliferação e invasão agressiva no tecido cerebral circundante normal. Em laboratórios médicos, o ensaio de ranhura – um teste in vitro – destaca-se por ser um método simples, fácil, barato e acessível para avaliar a migração e a proliferação celular.
OBJETIVO: Padronizar o ensaio de ranhura, utilizando drogas antimicrotúbulos como controles positivos.
MÉTODOS: As células de glioma U87MG foram semeadas em diferentes concentrações e, após 24 horas, a monocamada foi arranhada usando ponteiras de diferentes tamanhos para criar uma fenda sem células. As células foram então tratadas com colchicina e paclitaxel, com meio em ausência ou presença de soro fetal bovino. A ranhura foi fotografada com auxílio de microscópio invertido, e a área da ranhura foi medida por meio do programa Image J.
RESULTADOS: Ranhuras com bordas mais bem definidas e monocamada com aproximadamente 90% de confluência foram obtidas com 1,5 e 2 × 105 células/poço. A largura e a área das ranhuras obtidas foram, respectivamente, 948 µm/2,193 mm2; 964 µm/2,266 mm2; e 1448 µm/3,221 mm2 para as ponteiras de 10, 200 e 1000 µl. A colchicina inibiu o fechamento das ranhuras em 12,6% ou 2,4%, tanto na presença quanto na ausência de soro; o paclitaxel, em 3,4% e 6,7%, respectivamente.
CONCLUSÃO: Em condições padronizadas, colchicina e paclitaxel podem ser usados como controles positivos eficientes no teste in vitro de ranhura.

Palavras-chave: colchicina; paclitaxel; glioma; proliferação celular; movimento celular; ensaios de seleção de medicamentos antitumorais.